實時熒光定量PCR法進行無乳鏈球菌血清分型的實驗步驟

B組鏈球菌(GBS) 是一種熒光檢測帶有包膜的革蘭氏陽性菌，是新生兒侵襲性感染敗血癥和腦膜炎的重要原因，GBS血清抗體傳統分型法通常需要經過乳膠凝集、多重 PCR 和條帶大小分析或全基因組序列分析等步驟，過程繁瑣，技術成本昂貴，所以在PCR實驗室中采用實時熒光定量PCR 法進行血清分型不僅可以替代乳膠凝集法，還可以改進 GBS 血清型數據的采集。



GBS 細菌菌株分離與培養
將GBS 分離株在胰蛋白酶大豆 (TS) 或 5% 羊血瓊脂平板上于37°C 培養，然后在 TS 培養基中于 37°C 培養過夜。

通過乳膠凝集進行血清分型
根據制造商的說明，使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 試劑盒（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）通過乳膠凝集對所有 GBS 分離株進行血清分型。簡而言之，將 10 μl 乳膠試劑添加到懸浮在 10 μl 鹽水中的單個 GBS 菌落中。如果 30 秒后可見凝集，則旋轉反應并解釋為陽性。 

實時熒光定量法 PCR 進行血清分型
設計引物和探針以擴增無乳鏈球菌每種血清型的多糖莢膜基因的區別區域。引物中的寡核苷酸未經修飾和脫鹽，探針用熒光探針（5' 6-羧基熒光素 (6-FAM)）和兩種猝滅劑標記，并通過高壓液相色譜法純化.

PCR實時熒光定量分析
使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 從 GBS 的過夜培養物中提取基因組 DNA。PCR 反應最終體積為 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 無菌水、0.2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 探針（100 μM 儲備液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在 熒光定量PCR儀器上進行三次反應，并進行軟件分析。反應參數如下： 50°C 初始孵育 2 分鐘；在 95 °C 下初始變性 10 分鐘；在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分鐘下進行 35 個 PCR 循環。陽性反應定義為循環閾值（CT ) < 30 對于 50 ng DNA 模板/反應。每次運行都包含陰性對照反應（無 DNA 模板）。實驗結果與乳膠凝集進行比較。通過對比實驗發現使用實時熒光定量 PCR 方案檢測到預測序列，并且與任何其他血清型引物/探針組合沒有陽性反應。而后通過乳膠凝法集確認了 47 株菌株的血清型，由此驗證基于 PCR 的方法和乳膠凝集方法的血清分型結果無差異。
 實驗方法對比
我們知道用于 GBS 血清分型技術的基于非核酸的實驗室方法成本較高，并且需要高滴度的血清型特異性抗血清，并且會阻礙 GBS 血清型流行率的研究。而乳膠凝集試劑盒可若用于實驗室的 GBS 血清分型，其價格也較貴。通過分子莢膜分型技術，包括多重 PCR   全基因組序列的靶向分析新可用的序列信息的適應性和相對容易的性能，但僅能分血清型 Ia、Ib 和 III 三種血清型。

   與許多現有方法不同，實時 PCR 法的血清分型不是基于操作員對生化反應的解釋，它允許特異性鑒定 GBS 血清型，盡管會受到其他細菌 DNA 的干擾，但它可能在流行病學研究的背景下比較有用，作為現有多重 PCR 檢測的替代方法。隨著進一步的發展，這種新方法可以直接從標本中檢測 GBS 血清型，而無需培養。這種方法基于實時 PCR 的血清分型雖然便捷，但檢測由于需要特定的引物-探針組所以暫時無法直接識別新的血清型。

來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司